Научни постижения

По-важни научни постижения за последните 10 години

Стволови клетки

• Доказано е наличието на мезенхимни стволови клетки (МСК) в човешки ендометриум и децидуална тъкан. Тези клетки са размножавани и култивирани ин витро, и фенотипно характеризирани като стромални клетки с мезенхимен произход (CD29+, CD73+ и CD90+), негативни за маркери на хемопоетични клетки. Ендометриалните МСК имат: 15% клоногенна активност и способност за диференциация към адипогенни и ендотелно-подобни клетки. Изказана е хипотезата, че стромалните МСК участват в ремоделирането на ендометриума при менструалния цикъл на жената, както и при образуването на децидуата при бременност. R.Dimitrov, T.Timeva, D.Kyurkchiev, M.Stamenova, A.Shterev, P.Kostova, V. Zlatkov, I.Kehayov, S.Kyurkchiev. Characterization of clonogenic stromal cells isolated from human endometrium. Reproduction, (2008) 135 551–558; R.Dimitrov, D.Kyurkchiev, T.Timeva, M.Yunakova, M.Stamenova, A. Shterev, S.Kyurkchiev. Human pre-decidual stromal cells have the characteristics of mesenchymal stem cells. Fertil. Steril, 2010, 93 (1), 210-219; S.Kyurkchiev, A.Shterev, R.Dimitrov. Assessment on presence and characteristics of multipotent stromal cells in human endometrium and deciduas. Reproductive Biomedicine Online, 2010, 20 (3), 305 - 313
• Изследванията на влиянието на прогестерон и други репродуктивни хормони върху пролиферацията, диференциацията и имуномодулиращите свойства на мезенхимни стволови клетки, доведе до следните резултати - добавен към културалната среда прогестерон не променя пролиферативната способност на мезенхимни стволови клетки изолирани от костен мозък, мастна тъкан и ранна децидуа. Комбинацията от естрадиол, прогестерон и сАМР индуцира децидуализация на мезенхимни стволови клетки, като ефектът е най-силно проявен при тези, изолирани от ранна децидуа. D.Kyurkchiev, E.Ivanova-Todorova, S. Kyurkchiev. New target cells of the immunomodulatory effects of progesterone. Reproductive BioMedicine Online. 2010. 
• В наши разработки беше използвана стабилизирана клетъчна линия на чЕСК - BG01V, която беше поддържана в ко-култури с човешки мезенхимни стволови клетки, изолирани от мастна тъкан (АSC). При условия на продължително култивиране (около 20 пасажа) чЕСК запазиха плурипотентния си потенциал, както и способността си да се диференцират в ембрионални телца. Според събраните до момента експериментални факти се установи, че човешките мезенхимни стволови клетки могат да служат за фидерни клетки, поддържащи растежа на BG01V клетките при ко-култивиране. Те очевидно продуцират и секретират необходимите растежни фактори, които освен, че поддържат растежа на чЕСК от линия BG01, запазват и тяхнато недиференцирано състояние. Oreshkova, T., Stoyanova, E., Mourdjeva, M., Kyurkchiev, S. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells support the growth and plasticity of human embryonic stem cells (BG01V cell line). Comptes Rendus de L'Academie Bulgare des Sciences, 2010 
• Разработени са лабораторни протоколи за получаване на iPSC от мезенхимни стволови клетки изолирани от мастна тъкан с човешки произход и от търговска човешка фибробластна клетъчна линия BJ. Чрез трикомпонентна ретровирусна система, бяха намножени плазмиди, съдържащи секвенции на определени транскрипционни фактори (Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc). След въвеждането им в таргетните клетки беше установено изменение в морфологията на тези клетки и детектирана експресия на някои специфични маркери за плурипотентност. Натрупаните резулати от имунофуоресцентни оцветяваня, RT-PCR и FACS анализи сочат, че получените от нас клетки притежават някои от характеристиките на човешките ембрионални стволови клетки, но не експресират пълния набор от плурипотентни маркери.
• Разработени са методи за изолиране, култивиране ин витро и характеризиране на мезенхимни стволови клетки от човешки костен мозък, мастна тъкан, зъбна пулпа. При сравняване на мезенхимни стволови клетки, изолирани от костен мозък (км-МСК) и от мастна тъкан (мт-МСК) е установено, че клетките от двата източника имат почти идентични морфологични, имунофенотипни и клоногенни характеристики. По отношение на скорост на пролиферация ин витро се доказва, че мт-МСК имат по-висока пролиферативна способност, но по-слаб потенциал за диференциране като остеогенни клетки. Особено важен е фактът, че мт-МСК имат по-силно изразена потискаща активност върху синтезата на имуноглобулини от човешки В-клетки, което предполага тяхното приложение като имуномодулатор в клинични условия. Bochev, I., G. Elmadjian, D. Kyurkchiev, L. Tzvetanov, I. Altankova, P. Tivchev, S. Kyurkchiev. Mesenchymal stem cells from human bone marrow or adipose tissue differently modulate mitogen-stimulated B-cell immunoglobulin production in vitrо. Cell Biol Internatl., 32, 384 – 393. 2008; I.Bochev, S.Kyurkchiev. Immunomodulatory effects of human bone marrow or adipose tissue derived mesenchymal stem cells on T-helper cell cytokine production in vitro. Comptes Rendus de L'Academie Bulgare des Sciences 62 (12), pp. 1553-1558. 2009. 
• При характеризиране на клетки, изолирани от вена на пъпна връв е установено, че по своята морфологична и имунофенотипна характеристика те се отнасят към мезенхимните стволови клетки. Тези клетки експресират сървивин, bcl-2, виментин и ендоглин (CD 105), което е доказано както на ниво белтък чрез имунологични методи, така и на ниво иРНК чрез RT-PCR. Установен е факът, че след диференциране на тези клетки към ендотелно-подобни клетки не се открива експресия на сървивин. Това показва, че МСК са подходящи за прилагане с терапевтични цели, защото след диференциация техния пролиферативен потенциал намалява т.е. няма опасност от неконтролиран растеж на трансплантираните клетки S.Kestendjieva, D.Kyurkchiev, G.Tsvetkova, T.Mehandjiev, A.Dimitrov, A.Nikolov, S.Kyurkchiev. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from human umbilical cord. Cell Biol Internatl., 2008, 32,724 - 732

Търсене на маркери за туморни стволови клетки

• Изолирани са базални кератиноцити от нормален човешки епидермис. В първични човешки кератиноцити над 80% от клетките бяха CD 71dim, CD49bright, което е показателно за висок пролиферативен потенциал и ни позволява да допуснем, че в тях се съдържат висок брой стволови клетки. След отстраняване чрез клетъчен сорт на СD133+ клетъчна популация, се наблюдава загуба на спосoбността за формиране на колонии.
• При тестиране на получения срещу мембранна фракция от първични човешки кератиноцити серум чрез Western блот бяха идентифицирани две протеинови ивици в областта на 56.7 kDa и на 49.5 kDa. При сравняване на реактивността на получения поликлонален серум към мембранна и цитоплазмена фракция от BJ (човешки фибробласти) и SCC-9 (сквамозен клетъчен карцином от език) бяха установени същите доминантни бандове. При около 30% от първичните кератиноцити и при 10% от SCC-9 наблюдавахме специфично мембранно оцветяване, което има вид на гранули или рафтове, които е възможно да представляват групиране на рецептори. При човешки фибробласти от линията BJ подобно оцветяване не беше наблюдавано.

Имунорегулаторни механизми при бременност

• Произведено е моноклонално антитяло Мат3А6 срещу прогестерон-индуциран блокиращ фактор (PIBF), което е уникална специфична сонда, с възможно приложение в клиничната практика. Чрез Мат3А6 е доказано, че PIBF се експресира конститутивно в мезенхимни стволови клетки, изолирани от човешка децидуа. Експресията и секрецията на този белтък се модулира от репродуктивния стероиден хормон – прогестерон. Ivanova-Todorova, E., D. S. Kyurkchiev, A. Nalbanski, T. Timeva, A. Shterev, S. D. Kyurkchiev. Production and characterization of a novel monoclonal antibody against progesterone induced blocking factor (PIBF) - J. Reprod Immunol., 78, 94–101, 2008. Ivanova-Todorova, E., Kyurkchiev, D., Mourdjeva, M., Dimitrov, R., Stoyanova, E., Timeva, T., Yunakova, M., Shterev, A., Kyurkchiev, S. Pre-decidual multipotent stromal cells (PreDMSc) constitutively express progesterone induced blocking factor (PIBF). Comptes Rendus de L'Academie Bulgare des Sciences 2009.
• Установено е, че прогестеронът индуцира експресията на HLA-G в човешки мезенхимни стволови клетки, на ниво белтък и иРНК. Представените резултати доказват убедително, че прогестеронът предизвиква значителни промени във физиологията на мезенхимни стволови клетки от човешки произход като повлиява експресията на биологично активни фактори с имуномодулиращи свойства. E.Ivanova-Todorova, M.Mourdjeva, D.Kyurkchiev, I.Bochev, E.Stoyanova, R.Dimitrov, T.Timeva, M.Yunakova, D.Bukarev, A.Shterev, P.Tivchev, S.Kyurkchiev. HLA-G Expression Is Up-Regulated by Progesterone in Mesenchymal Stem Cells. Am J Reprod Immunol; 2009. Mourdjeva, M., Ivanova-Todorova, E., Kyurkchiev, D., Bochev, I., Stoyanova, E., Dimitrov, R., Kyurkchiev, S. Progesterone enhances the HLA-G expression in mesenchymal stem cells. Comptes Rendus de L'Academie Bulgare des Sciences,62(12), pp.1559-1566. 2009.
• Установено е, че женските репродуктивни хормони прогестерон и естрадиол ускоряват съзряването и усилват апоптозата при човешки зрели дендритни клетки т.е. ускоряват жизнения цикъл на дендритините клетки. Двата хормона повишават секрецията на цитокините IL-10 и IL-27, а само прогестеронът увеличава продукцията на IL-13, но потиска секрецията на IL-23. Тези резултати разкриват нови механизми, чрез които репродуктивните стероидни хормони осъществяват имуномодулиращ ефект по време на бременността при човека. Ivanova E., D. Kyurkchiev, I. Altankova, J. Dimitrov, E. Binakova, S. Kyurkchiev. CD83+ monocyte-derived dendritic cells are present in human decidua and progesterone induces their differentiation in vitro. Amer. J. Reprod. Immunol., 53, 1-7, 2005. Kyurkchiev D., E. Ivanova-Todorova, S. Hayrabedyan, I. Altankova, S. Kyurkchiev. Female sex steroid hormones modify some regulatory properties of monocyte-derived dendritic cells. Amer. J. Reprod. Immunol., 58, 425–433, 2007
• Посредством произведено срещу фосфатидилсерин /PS/ моноклонално антитяло 1Н6 е изследвана екстернализацията на PS с методите на флоуцитометрия и имунофлуоресценция. Описан е модел на динамика на екстернализация на PS по време на апоптоза. Добавянето на прогестерон във физиологични дози понижава екстернализацията на PS при дендритни клетки, T-клетки и при моноцитно макрофагиалната линия U937. Mourdjeva M., D. Kyurkchiev, A. Mandinova, I. Altankova, I. Kehayov, S. Kyurkchiev. Dynamics of membrane translocation of phosphatidylserine during apoptosis detected by a monoclonal antibody. Apoptosis, 10, 209-217, 2005. Mourdjeva M., Z. Popova, D. Kyurkchiev, K. Kontinopoulou, I. Altankova, I. Kehayov, S. Kyurkchiev. Progesterone-modulated Phosohatidylserine Externalization in Apoptosis and Activation of Jurkat Cells. AJRI, 56, 1-9, 2006.. Получените резултати откриват нови перспективи при изследване на взаимовръзката репродуктивни хормони и лимфоидни клетки, особено в аспекта на специфични техни състояния, свързани с автоимунитета, като апоптоза или активация.
• Проведени са изследвания върху клетъчни механизми, участващи в индуцирането на автоимунен отговор срещу човешки бета-2 гликопротеин І /B2-GPI/. Установено е, че човешки дендритни клетки се диференцират в система ин витро и преференциално ендоцитират B2-GPI/cardiolipine комплекса, но не и нативната форма на B2-GPI. Чрез флоуцитометричен анализ е доказано, че след ендоцитоза, дендритните клетки „представят” епитопи, които се разпознават от специфични моноклонални антитела срещу човешки B2-GPI. Резултатите показват, че B2-GPI/CL комплексът е имуногенен и е в състояние да индуцира автоимунен отговор, водещ до синтеза на anti-B2-GPI антитела. Изследванията разкриват ролята на клетъчно-обусловените имунни реакции в патогенезата на анти-фосфолипидния синдром, който е една от причините за безплодие при човека. 
• Характеризирана е епитопната специфичност на серумния протеин β2-GPI (кофактор на фосфолипиди) чрез приложение на моноклонални, поликлонални,  автоимунни и хиперимунни серуми. Тези резултати дават основание да се направи извода, че молекула на β2-GPI би могла да предизвика продукция на различни популации от антитела, част, от които да имат патологичен ефект. Този факт е от значение при изясняване ролята на антифосфолипидните антитела и в частност  на β2-GPI–зависимите антитела при една неуспешна бременност. . Kyurkchiev, D., Alexandrova, K., Nalbanski, A., Robeva, R., Stamenova, M., Altankova, I., Kyurkchiev,S Analysis of epitopes of beta-2-glycoprotein recognized by autoantibodies. (2002) Clinical Application of Immunology,1 (1), pp.53-57.
• Получени са моноклонални антитела срещу атриален натриуретичен пептид /ANP/. Установена е клетъчно-специфичната локализация на ANP в тестис на плъх от късно фетална до полово зряла възраст. Локализацията на пептида е в Лайдиговите, Сертолиевите и герминативните клетки. Проследена е клетъчната локализация на пептида в плъши яйчник в периода на пубертета и след третиране с гонадотропен хормон. Имунохистохимично е доказана експресия на ANP във всички стероид - продуциращи клетки и в развиващите се ооцити A.Russinova, M.Mourdjeva, C. Valkova, S.Kyurkchiev, I.Kehayov. Immunocytochemical Localization Of Atrial Natriuretic Factor (ANF) In Rat Female Reproductive Tract: Evidences For A Potential Hormonal Regulation. Biology of the cell 94 (2002) 91-98 Mourdjeva M, Russinova A, Kyurkchiev S, Kehayov I. Spatial and temporal distribution of atrial natriuretic factor in the rat testis. Biol Cell 2001 Nov 93:5 301-7. Russinova A., M.Mourdjeva, S.Kyurkchiev, I.Kehayov. Immunohistochemical detection of atrial natriuretic factor (ANF) in different ovarian cell types. Endocrine Regulation, 2001, 35, 81-89. M.Bakalska, M.Mourdjeva, A.Russinova, S.Kyurkchiev, I.Kehayov.. Localization of ANP in rat testis after leydig cell destruction: evidence for a potential role in regulating gonadal function. Endocrine regulations 1999, Vol. 33, 183-191.

Ендометриоза

• Приложени са имуноцитохимични и имуноензимни методи за установяване експресията на ангиогенни фактори и специфични туморни маркери в ендометриозна тъкан. Използвани са получени в секцията моноклонални антитела срещу IL-1 alpha, FGF-1 и овариален карцином. За имуноцитохимичната локализация на ангиогенни фактори са приложени и поликлонални антитела срещу S100A13 и ендоглин. Hayrabedyan S., S. Kyurkchiev, I. Kehayov. Endoglin (CD105) and S100A13 as markers of active angiogenesis in endometriosis. Reprod. Biol., 5, /1/, 51-67, 2005.  Hayrabedyan S., S. Kyurkchiev, I. Kehayov. FGF-1 and S100A13 possibly contribute to angiogenesis in endometriosis. J. Reprod. Immunol., 67, /1-2/, 87-101, 2006. Hayrabedyan, S., S. Kyurkchiev, I. Kehayov. Calcium-binding protein S100A13 is overexpressed in endometriosis - C. r. Acad. bulg Sci, 2008, 61(2), 281-288.
• Установени са качествени и количествени разлики между перитонеални течности от пациентки с ендометриоза и контролни перитонеални течности, което дава основание да се допусне наличие на маркерни молекули, които да се използват за целите на неинвазивната диагностика на ендометриозата. Dimitrov, R., Nalbansky, A., Mollova, M., Stamenova, M., Kyurkchiev, S Autoantibodies in sera from women with endometriosis against components of peritoneal fluid. (2004) Clinical Application of Immunology, 3(1), pp.306-309. Zasheva, D., Dimitrov, R., Stamenova, M. Endometriosis and the role of the integrins in the pathogenesis of the endometriosis. (2007) Akusherstvo i ginekologia, 46 (5), pp. 37-48.
• Доказано е наличието на автоантитела в серума на пациентките с ендометриоза към компоненти на перитонеалната им течност. Dimitrov, R., Nalbansky, A., Mollova, M., Stamenova, M., Kyurkchiev, S Autoantibodies in sera from women with endometriosis against components of peritoneal fluid. (2004) Clinical Application of Immunology, 3(1), pp.306-309. 
• Получени са данни за неблагоприятния ефект на перитонеалната течност от инфертилни жени с ендометриоза върху сперматозоидни параметри със значение за оплодителния потенциал на сперматозоидите.
• Установен е отрицателен ефект на перитонеалната течност от жени с ендометриоза върху процеса на децидуализация на предeцидуални стромални клетки in vitro. Този факт подкрепя възможността за съществуване на вероятен механизъм за въздействие на перитонеалната течност при жени с ендометриоза върху рецептивните им способности и може да се свърже с възникване на инфертилитет при пациентки с ендометриоза.

Тумори

• Проследена е активността на конструкта survivin-siRNA върху клетки от линията PC-3 (простатно-карциномни клетки). Относителните белтъчни нива са получени след имуноблот анализ на три независими експеримента. Генната експресия на сървивин-siRNA и на контролна siRNA е проследена чрез “real-time” RT-PCR. Двете експериментални постановки – имуноблот и real-time RT-PCR показаха значително понижение на белтъчните нива на сървивин и съответните на иРНК нива след трансфекция със специфична siRNA в РС-3 клетъчна линия. M.Mourdjeva, A.Mandinova, S.Kyurkchiev, I.Kehayov. Experimental data for inhibition of the expression of surviving by small interfering RNA molecules (siRNAs). C.r.Acad Bulg Sci, 2009.
• Проследена е експресията на нискомолекулни стресови протеини (αВ-кристалин и Hsp27) в нормални репродуктивни тъкани и туморни образувания чрез имунофлуоресценция, Western immunoblot, Northern blot и Real Time Q-PCR. Чрез тези методи бе установена експресия на двата протеина в човешка плацента, плъши тестис, яйчник на човек, и разлика в експресията  на αВ-кристалин между доброкачествени и злокачествени туморни образувания  -   висока степен на експресия на αВ-кристалин в доброкачествени тумори и липса на експресия в злокачествени образувания. Mineva, I., Gartner, W., Hauser, P., Kainz, A., Löffler, M., Wolf, G., Oberbauer, R., Weissel, M., Wagner, L. Differential expression of alphaB-crystallin and Hsp27-1 in anaplastic thyroid carcinomas because of tumor-specific alphaB-crystallin gene (CRYAB) silencing (2005) Cell Stress and Chaperones, 10 (3), pp. 171-184; Mineva, I., Stamenova, M., Gartner, W., Wagner, L Expression of the small heat shock protein alphaB-crystallin in term human placenta. (2008) American Journal of Reproductive Immunology,60 (5), pp. 440-448.
• При изследвания на пациенти с простатен карцином, подложени на специфична. ДНК ваксинация, е доказано, че в резултат на тази процедура в пациентите се развива хуморален имунен отговор, който се проявява с продукцията на антитела срещу простатно-специфичен мембранен антиген. Тези резултати подкрепят идеята за ДНК ваксинация като вероятен терапевтичен подход.  Todorova K., S. Zoubak, M. Mincheff, S. Kyurkchiev. Biochemical Nature and mapping of PSMA epitopes recognized by human antibodies induced after immunization with gene-based vaccines. Anticancer research, 25, 4727-4732, 2005. ISSN 0250-7005. IF - 1.604Todorova K., I. Ignatova, S. Tchakarov, I. Altankova, S. Zoubak, S. Kyurkchiev, M. Mincheff. Humoral immune response in prostate cancer patients after immunization with gene-based vaccines that encode for a protein that is proteasomally degraded. Cancer Immunity, 5, 1-9, 2005